DNA 클린업 및 크기 선택을 위한 SPRI 비드 대 샘플 비율
비드 대 샘플 비율이란?
비드 대 샘플 비율은, 비드 비율 이라고도 하며, AMPure XP, SPRIselect, 또는 RNAClean XP와 같은 SPRI 비드 기반 시약을 사용하는 DNA 클린업 및 크기 선별에서 중요한 요소입니다. 이는 비드 기반 시약의 볼륨과 핵산 샘플의 볼륨간의 비율을 말합니다.
DNA 클린업을 위한 AMPure XP 비드 비율
SPRI 기술기반의 AMPure XP 시약이 PCR 정제 및 차세대 염기서열 분석(NGS) 클린업에 사용됩니다. 이는 100bp 이상의 높은 앰플리콘 회수율과 통합되지 않은 dNTP, 프라이머, 프라이머 이량체, 염류 및 기타 오염 물질의 효율적인 제거를 보장합니다.DNA 클린업 시 AMPure XP의 권장 비드 비율은 1.8입니다. 이 값은 DNA 샘플의 볼륨을 기준으로 필요한 AMPure XP 비드의 볼륨을 나타냅니다. 반응당 AMPure XP 시약의 볼륨을 결정하려면 DNA 샘플의 볼륨에 1.8을 곱합니다.
AMPure XP 비드 비율 값을 변경하면 출력 샘플의 DNA 단편 길이 범위에 영향을 미칩니다(그림 1). 일부 공급업체는 AMPure XP 시약을 사용하는 DNA 크기 선택 프로토콜을 개발했습니다. 하지만 크기 선택에는 이 적용 분야를 위해 의도적으로 검증된 SPRIselect 시약을 사용하는 것이 좋습니다.
| 차트 색상 | 비드/샘플 비율 |
| PINK | Input/Reference |
| RED | 1.8X |
| BLUE | 0.9X |
| GREEN | 0.7X |
| AQUA | 0.6X |
Figure 1. Agilent TapeStation 시스템은 AMPure XP 시약인 시약 “K”와 시약 “O&rdquo를 사용하여 정제된 전단 gDNA를 추적합니다. 클린업은 1.8x (red), 0.9x (blue), 0.7x (green)와 0.6x (aqua) 비드 대 샘플 비율을 사용하여 수행되었습니다. 추적은 피크 높이와 회수 효율성의 상대적 차이를 보여줍니다.
다양한 시약의 추적을 비교한 결과, AMPure XP 시약만이 효율적인 회수를 유지하면서 예측 가능한 성능을 제공했습니다. 이는 추적에서 참조와 1.8X 비율 간의 상대적 차이로 입증되었습니다.
DNA 크기 선택을 위한 SPRIselect 비드 비율
SPRIselect 시약은 DNA 크기 선별 과정에서 향상된 유연성과 제어를 제공합니다. DNA의 크기가 원하는 염기서열 분석 결과에 직접적인 영향을 미치기 때문에 이 시약은 NGS를 위한 단편 라이브러리 준비에 널리 사용됩니다.
SPRIselect 시약을 사용하면 연구자가 다양한 유형의 크기 선별을 수행할 수 있습니다.:
- Left Side 사이즈 선별: 이 방법은 목표 크기보다 작은 DNA 단편을 제거하여 더 큰 단편을 선택할 수 있게 합니다.
- Right Side 사이즈 선별: 반대로, 이 방법은 목표 크기보다 더 긴 DNA 단편을 제거하여 더 작은 단편을 선택할 수 있게 합니다.
- Double 사이즈 선별: 이 방법은 최소 크기와 최대 크기 사이(150bp 이상 및 800bp 이하)에 있는 특정 범위의 DNA 조각을 포함하도록 합니다.
DNA 크기 선택 프로토콜에서 사용되는 비드 비율은 선택 측면 및 선택 지점에 따라 달라집니다.:
Double Size 선택 프로토콜에 사용되는 비드 비율에 대한 자세한 내용은 SPRIselect 사용자 가이드를 참조하십시오.
비율이 다른 키트로 전환하는 경우의 영향
모든 비드 기반 클린업 시약이 1.8x 비드 비율을 사용하는 것은 아닙니다. 그림 3과 같이 여러 제조업체의 서로 다른 12개 클린업 키트 중에서 클린업에 1.8x 비드 비율을 사용하도록 제안하는 제품은 AMPure XP와 SPRIselect 시약을 포함하여 5개뿐입니다.
다른 클린업 시약으로 바꾸려고 계획하는 경우 다음을 포함한 잠재적인 결과를 고려해야 합니다.
- 중요한 단편의 손실: 서로 다른 비드 비율이 결합의 효율성 및 특정 DNA 단편의 회수에 영향을 미칠 수 있습니다. 비율이 다른 키트로 변경하면 연구에 특히 중요한 단편이 손실될 수 있습니다.
- 비드 비율의 재계산: 새로운 클린업 시약을 채택하면 제조업체가 제공하는 구체적인 권장 사항을 기준으로 비드 비율을 재계산해야 합니다.
- 실험실 프로토콜 재작성: 전에 프로토콜에 표준 1.8x 비드 비율을 사용했던 실험실은 새로운 클린업 시약과 관련된 특정 비드 비율을 반영하도록 지침을 업데이트하고 수정해야 합니다.
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